光子学报  2017, Vol. 46 Issue (6): 0612004  DOI: 10.3788/gzxb20174606.0612004
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引用本文  

陈功, 朱锡芳, 窦晓鸣, 刘晨晨, 许清泉, 山口佳则, 倪一. 毛细管电泳噪声特性分析[J]. 光子学报, 2017, 46(6): 0612004. DOI: 10.3788/gzxb20174606.0612004.
CHEN Gong, ZHU Xi-fang, DOU Xiao-ming, LIU Chen-chen, XU Qing-quan, YAMAGUCHI Yoshinori, NI Yi. Analysis of Capillary Electrophoresis Noise Characteristics[J]. Acta Photonica Sinica, 2017, 46(6): 0612004. DOI: 10.3788/gzxb20174606.0612004.

基金项目

国家自然科学基金(No.21305089)、江苏省自然科学基金青年基金(No.BK20130245)、水声通信与海洋信息技术教育部重点实验室(厦门大学)和江苏省青蓝工程优秀青年骨干教师人才计划(2017年)资助

第一作者

陈功(1979-), 男, 副教授, 博士后, 主要研究方向为生物分子诊断信息处理.Email:realchengong@sina.com

通讯作者

朱锡芳(1965-), 男, 教授, 博士, 主要研究方向为光学工程.Email:zhuxf@czu.cn

文章历史

收稿日期:2016-12-21
录用日期:2017-01-24
毛细管电泳噪声特性分析
陈功1,2, 朱锡芳1, 窦晓鸣2, 刘晨晨2, 许清泉1, 山口佳则2, 倪一2    
(1 常州工学院 电气与光电工程学院, 江苏 常州 213022)
(2 华东理工大学 理学院, 上海 200237)
摘要:为优化毛细管电泳荧光信号检测系统,提高检测灵敏度,以100~1 000碱基对的脱氧核糖核酸作为分离对象,羟乙基纤维素为筛分介质,研究了直流电场下毛细管电泳荧光信号检测系统中的噪声特性.对不同分离电场强度、羟乙基纤维素溶液浓度和分子量、毛细管有效长度以及毛细管内径形状等情况下的噪声特性进行分析.分析得到该检测系统中信噪比最佳的优化参量,即分离电场强度为500~600 V/cm、羟乙基纤维素浓度为0.6%~0.7%、羟乙基纤维素分子量为250、圆形内径为50 μm以及毛细管有效长度为8 cm.
关键词荧光    毛细管电泳    噪声特性    脱氧核糖核酸    灵敏度    
中图分类号:TH841      文献标识码:A      文章编号:1004-4213(2017)06-0612004-9
Analysis of Capillary Electrophoresis Noise Characteristics
CHEN Gong1,2, ZHU Xi-fang1, DOU Xiao-ming2, LIU Chen-chen2, XU Qing-quan1, YAMAGUCHI Yoshinori2, NI Yi2    
(1 School of Electrical and Photoelectronic Engineering, Changzhou Institute of Technology, Changzhou, Jiangsu 213022, China)
(2 School of Science, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Foundation item: The National Natural Science Foundation of China (No.21305089), Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China (No. BK20130245), Key Laboratory of Underwater Acoustic Communication and Marine Information Technology (Xiamen University) and Qinglan Project of Jiangsu Province
Abstract: In order to optimize the fluorescence detection capillary electrophoresis system and improve the detection sensitivity, the signal noise characters were studied when separating 100~1 000 base pair deoxyribonucleic acid ladder under direct current electric field in hydroxyethyl cellulose solutions. The dependence of signal noise on separation electric field intensity, polymer concentration, hydroxyethyl cellulose molecular weight, the effective length and the capillary shape were investigated. Experiment result shows that optimum parameters can be obtained under best signal noise ratio, which are the separation electric field strength of 500~600 V/cm, hydroxyethyl cellulose concentration of 0.6%~0.7%、hydroxyethyl cellulose molecular weight of 250, round inner diameter of 50 μm and effective capillary length of 8 cm.
Key words: Fluorescence    Capillary electrophoresis    Noise characteristics    Deoxyribonucleic acid    Sensitivity    
OCIS Codes: 120.1880;300.2530;070.4790
0 引言

毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)作为高效的微分离分析方法被广泛应用于临床医学、分子生物检测及蛋白质与核酸的分离分析等领域[1-2].毛细管电泳荧光信号检测系统噪声通常有来自于分析仪器的杂散光噪声、放大电路的噪声、光电倍增管的噪声、静态光学噪声、激光器开启的静态噪声和脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)电泳时引起的动态噪声等.在毛细管电泳中,有效信号的分离以及碱基信号峰的识别率都受到这些噪声的影响,如果能明确噪声来源,就能有针对性地从源头上采用物理措施、从检测分析阶段采用信号处理方法来抑制噪声,提高荧光信号的信噪比.

文献[3-6]针对毛细管电泳时引起的动态噪声,采用小波分析方法实现非平稳电泳荧光信号的去噪.文献[7]通过软件模拟得到毛细管内的激发光光斑对毛细管各个角度的光强,用来考察毛细管内径对噪音分布的影响,通过软件模拟电泳分离DNA的筛分介质引起瑞利散射噪声.文献[8]提出光谱恢复的方法、文献[9]采用电泳背景噪声的估计方法实现信噪比的提升.上述研究方法主要侧重研究毛细管电泳荧光信号检测系统中激光器开启时毛细管电泳引起的动态噪声,并采用高效的信号处理技术实现信噪比的提升.目前鲜有文献全面分析毛细管检测系统噪声的来源、试验条件和实验对象改变时噪声的变化规律.本文采用自制毛细管电泳系统,以100~1000碱基对(base pair,bp) DNA (日本Takara株式会社)为分离对象,研究在直流电场下羟乙基纤维素(Hydroxyethyl Cellulose,HEC)溶液中毛细管电泳分离DNA时的噪声特性.

1 噪声来源及实验结果

实验系统主要设备有石英毛细管(美国Polymimicro Technologies公司)、倒置显微镜IX71(日本Olympus公司)、MODEL 610E高压电源(美国Trek公司)、汞灯光源、U-MWIB-3滤光片(日本Olympus公司)、60×物镜PlanApo/IR (日本Olympus公司)和R928光电倍增管(Photoelectric Multiplier Tube,PMT) (日本Hamamatsu Photonics公司),化学试剂包括SYBR Green I (美国Invitrogen公司),10×Tris-硼酸-EDTA缓冲液(Tris Borate EDTA,TBE)(美国Bio-Rad公司).

1.1 分析仪器的噪声

毛细管电泳荧光信号检测系统中,分析仪器的噪声主要包括:外部可见光进入系统,经内部构件的多次反射、折射或衍射到达探测器形成的外部杂散光;光学系统内温控热源及温度较高的光学构件产生的红外辐射,经过系统表面的反射、折射或衍射传播进入探测器的内部杂散光;成像光线经非光路表面散射或经光路表面的非正常传播而进入探测器的成像杂散光[10].

系统采用遮光布和遮光板阻挡外部杂散光;构建密闭箱、保持实验室恒温通风环境避免内部杂散光;安装摄影镜头遮光罩和挡光环阻挡成像杂散光.

1.2 放大电路的噪声

光电倍增管后端的放大电路模块中主要存在散粒噪声、热噪声和闪烁噪声.散粒噪声与电流流动相关,其为频谱均匀分散的白噪声;热噪声也是白噪声,只与绝对温度相关;闪烁噪声也称为1/f噪声, 其存在于所有的有源元器件中[11].从图 1可以看出,前置放大器的输出端噪声表现为散粒和热噪声,其幅度在0~0.34 mV波动,个别较大闪烁噪声,电压不超过±0.7 mV.

图 1 放大电路的噪声 Fig.1 Noise from amplifier circuit
1.3 光电倍增管的噪声

光电倍增管(Photomultiplier, PMT)的噪声主要来源于光电子发射和二次发射电子倍增管所引起的噪声以及PMT设计、制造所引起的噪声,其中包括光阴极的热离子发射、倍增管寄生气体电离、输出级到阴极的光反馈以及PMT材料自发发射所引起的随机噪声[12-15].

实验中将PMT和放大电路用数据线连接,关闭激光器,用黑纸挡住光电倍增管光路,此时PMT噪声主要与其设计和制造相关.打开连接PMT电源,测量输出噪声,采集到的波形如图 2,可以看出PMT的背景噪声的电平主要集中在2.5~10 mV.

图 2 光电倍增管的噪声 Fig.2 Noise from photoelectric multiplier tube
1.4 未加分离电场时的静态噪声 1.4.1 未加荧光染料

毛细管内填充含有0.5× TBE的HEC缓冲溶液,未添加SYBR Green I荧光染料.开启激光器,不加分离电场,采集到的噪声波形如图 3(a).从图中可以看出,激发光路中放入带有缓冲液的毛细管时,本底噪声的电平主要集中在8~15 mV.

图 3 静态噪声 Fig.3 Static noise
1.4.2 加荧光染料

毛细管内填充含有SYBR Green I荧光染料的HEC缓冲溶液,不加分离电场,采集到的噪声波形如图 3(b).从图中可以看出,激发光路中放入带有缓冲液的毛细管时,本底噪声的电平主要集中在10~25 mV.

1.5 加分离电场时DNA毛细管电泳引起的动态噪声

毛细管内填充SYBR Green I荧光染料的HEC缓冲溶液,以100~1 000 bp DNA为分离对象,两端施加直流电压,DNA在毛细管电泳时引起动态噪声,分析不同条件下毛细管电泳分离DNA的实验结果.

1.5.1 分离电场强度、HEC浓度时噪声特性

图 4显示了分离电场强度对噪声特性的影响,其中ltle分别表示毛细管总长度和有效长度,le/lt=6/11,引入电场100 V/cm,引入电场时长2.0 s,HEC分子量1 300 k,有效长度为4 mm、圆形内径为50 μm.可以看出:噪声均值在0.2~0.45 V范围内;对于不同浓度的HEC,电场强度与噪声均值、方差成正比关系.图 5显示了HEC浓度对噪声特性的影响,参量与图 4相同.可以看出:噪声均值在0.2~0.45 V范围内;对于不同分离电场强度,HEC浓度与噪声均值、方差成反比关系.

图 4 电场强度对噪声的影响 Fig.4 Noise with changing electric field intensity
图 5 HEC浓度对噪声的影响 Fig.5 Noise with changing HEC concentration
1.5.2 不同分子量时噪声特性

图 6为HEC分子量对噪声特性的影响,le/lt=6/11,引入电场100 V/cm,引入电场时长2.0 s,分离电场300 V/cm.可以看出:筛分介质浓度相同时,噪声均值、方差与HEC分子量成正比;筛分介质分子量相同时,浓度越高,噪声均值和方差也越高.

图 6 HEC分子量对DNA电泳噪声的影响 Fig.6 DNA electrophoresis noise from HEC molecular weight
1.5.3 不同毛细管类型时噪声特性

图 7为毛细管电泳时,DNA分离效率、噪声特性随毛细管内径形状的变化关系,le/lt=6/11,引入电场100 V/cm,引入电场时长0.5 s,HEC浓度0.3%,分子量1 300 k.选用圆形截面毛细管的内径为75 μm、50 μm,毛细管正方形内截面边长为50 μm.

图 7 不同毛细管类型对DNA分离噪声的影响 Fig.7 DNA separation noise from different types of capillary
1.5.4 不同毛细管有效长度时噪声特性

在相同的筛分介质中,若毛细管上所加的电场强度一定,DNA淌度与分离度随毛细管有效长度变化关系如图 8,引入电场100 V/cm,引入电场时长0.5 s,分离电场300 V/cm,HEC浓度0.3%、分子量1 300 k.

图 8 毛细管有效长度对DNA分离的影响 Fig.8 DNA separation noise from length of capillary
2 实验分析和讨论 2.1 电场强度、HEC浓度对噪声影响分析

为进一步说明不同分离电场强度和HEC浓度对DNA分离噪声的影响,从DNA分离淌度、DNA迁移时间、DNA大小和DNA分离效率等角度进行分析.

图 9显示了毛细管电泳时不同分离电场强度下DNA分离淌度随DNA大小的变化关系.可以看出:HEC浓度不变时,电场强度越高,相邻DNA片段之间淌度差越高;HEC浓度越高,DNA在HEC中迁移淌度越低.考虑到带电粒子在流体中运动时,溶剂阻力Ff与粒子运动速度v和溶剂粘度η成正比,即Ffηv,带电量为q的粒子在电场作用下所受电场作用力为FE=qE, 当带电粒子在电场作用下运动稳定后FfFE,可知v=(qE)/η[16].所以,电场强度增大,DNA在毛细管内迁移速度增大,引起电泳时动态噪声波动的增加,但是由于HEC浓度增加使带电粒子稳定,导致DNA在毛细管内迁移速度的稳定,对应动态噪声波动减弱.

图 9 电场强度对DNA分离淌度影响 Fig.9 DNA mobility from electric field

图 10显示了不同大小DNA的分离效率随电场强度变化状况.由图可知,电场强度越高,DNA迁移时间越短.事实上由于v=(qE)/η,迁移时间为t=(leη)/(qE).DNA迁移时间与电场强度成反比.因此电场强度增加,系统动态噪声增加但噪声持续时间较短,电场强度减少,系统动态噪声减少但噪声持续时间较长.

图 10 电场强度对DNA分离效率的影响 Fig.10 DNA separation efficiency from electric field

图 11显示了不同电场强度下,毛细管电泳分离DNA时对应的分离度.可以看出HEC浓度较高时的分离度高于浓度较低时的分离度5倍左右.

图 11 电场强度对分离度的影响 Fig.11 Separation from electric field

综上,对于分离电场强度的变化,由于HEC缓冲液内部所产生的热量与毛细管两端的电压成正比,电压增加导致缓冲液的焦耳热增加,使得凝胶的粘度降低,DNA片段迁移的阻力变小,DNA各片段迁移速度变快,噪声波动增加.考虑到电压的提高可以增加毛细管的分离淌度,因此,以500~600 V/cm的分离电场强度进行研究为宜.

对于HEC浓度的变化,浓度较低的HEC未达到稳定的筛分结构,DNA片段迁移受到阻力较小,DNA各片段迁移速度快,因此噪声较大,但是分离度较弱.HEC浓度提高时,DNA各片段迁移受到阻力增加,分离时间变长,此时分离度高,噪声波动特性不明显.因此,以0.6%~0.7%的HEC浓度进行研究为宜.

2.2 分子量对噪声影响分析

图 12中,筛分介质浓度相同时,HEC分子量越大,相邻DNA片段之间淌度差越高;HEC分子量相同时,筛分介质浓度越高,DNA在高浓度HEC中分离淌度越低.HEC分子量越大,毛细管电泳时更容易透射荧光,表现出更高的噪声均值和方差.因此,以较低的HEC分子量进行研究为宜.

图 12 HEC分子量对噪声的影响分析 Fig.12 Analysis of DNA electrophoresis noise from HEC molecular weight
2.3 毛细管对噪声影响分析

毛细管类型不同时,毛细管噪声的均值范围约0.13~0.21 V,噪声均值和方差均与随着侧面积与截面积之比成反比.当毛细管电泳时,侧面积与截面积之比较小,毛细管中筛分介质产生焦耳热过大不能及时逸散,随着热量增加,离子运动速度加快,导致毛细管电泳DNA分离效率降低以及噪声的增加.在DNA分离实验中,若采用50 μm方形的较小内径的毛细管作为分离柱,在相对较高的分离场强下,能提高分离速度.但若毛细管内径过小,会减小检测时的光程.因此,选用50 μm圆形内径的毛细管作为分离柱为宜.

毛细管有效长度不同时,由于毛细管两端电场强度一定,在相同的介质中相邻的DNA各片段速度差恒定,毛细管长度越长,迁移时间越长,分离度与毛细管有效长度成正比.但DNA分子与筛分介质由于相互作用,其形状与运动路径在不断变化,且变化呈现随机性.因此在不同DNA片段位置的淌度以及噪声均值、方差也呈现一定的随机性.

2.4 毛细管电泳最佳优化参量

综合比较毛细管电泳荧光信号检测系统中的噪声情况可知:分析仪器中电路噪声均值约在1 mV以下,光电倍增管的噪声均值约在20 mV以下,加入含荧光染料的缓冲溶液背景噪声均值在50 mV以下;分离电场、HEC浓度变化时噪声均值变化范围为0.2~0.5 V;HEC分子量变化时噪声均值变化范围为0.05~0.3 V;毛细管类型改变时噪声均值变化范围为0.1~0.5 V.

通过分析,试验中最佳优化指标参量为:500~600 V/cm的分离电场强度、0.6%~0.7%的HEC浓度、250HEC分子量、50 μm圆形内径和8 cm有效长度的毛细管.图 13为利用毛细管电泳荧光信号检测系统进行实验时参量指标优化前后的相对荧光强度比较数据,图(a)~(d)分别表示最优参量、改变电场强度、改变HEC浓度和改变分子量的非优化参量对比,图 13(a)中噪声波动性明显低于其它三组情况,通过对比发现本文所给出参量的优越性.

图 13 毛细管电泳对比 Fig.13 Comparison of capillary electrophoresis results
3 结论

本文从毛细管电泳荧光信号检测系统中噪声来源的角度研究和分析噪声对系统检测性能的影响,并给出系统最优参量.研究发现影响检测性能的主要噪声来源于激光器开启时电泳所引起的噪声.不同分离电场强度、HEC溶液浓度和分子量、毛细管有效类型等环节的噪声均不同程度地引起电泳噪声的波动.在实现电泳过程中,需要根据现有条件合理选择仪器参量、试验用品和试验试剂,以实现最佳检测性能.

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