光子学报  2017, Vol. 46 Issue (9): 0923003  DOI: 10.3788/gzxb20174609.0923003
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引用本文  

姜利英, 刘帅, 任林娇, 张培, 闫艳霞, 郑晓婉, 陈青华, 姜素霞. 基于荧光共振能量转移的核酸适体传感器研究[J]. 光子学报, 2017, 46(9): 0923003. DOI: 10.3788/gzxb20174609.0923003.
JIANG Li-ying, LIU Shuai, REN Lin-jiao, ZHANG Pei, YAN Yan-xia, ZHENG Xiao-wan, CHEN Qing-hua, JIANG Su-xia. Study of the Fluorescent Aptasensor Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer[J]. Acta Photonica Sinica, 2017, 46(9): 0923003. DOI: 10.3788/gzxb20174609.0923003.

基金项目

国家自然科学基金项目(No.61002007)、河南省科技创新人才计划项目(No.124100510001)、郑州轻工业学院博士科研基金项目(Nos.2014BSJJ041;2015BSJJ023)和郑州轻工业学院2016年度研究生科技创新基金项目(No.2016027)资助

第一作者

姜利英(1981-), 女, 教授, 博士, 主要研究方向为生物传感器及检测微系统.Email: jiangliying@zzuli.edu.cn

文章历史

收稿日期:2016-12-28
录用日期:2017-04-20
基于荧光共振能量转移的核酸适体传感器研究
姜利英, 刘帅, 任林娇, 张培, 闫艳霞, 郑晓婉, 陈青华, 姜素霞    
(郑州轻工业学院 电气信息工程学院, 郑州 450002)
摘要:基于荧光共振能量转移的原理,以修饰于核酸适体上的FAM作为能量供体,以氧化石墨烯作为能量受体,构建了荧光适体传感器,分别对不同浓度的胰岛素和多巴胺进行检测.结果表明,胰岛素的线性检测范围为0.05~10 μmol/L,多巴胺的线性检测范围为1~500 μmol/L,当胰岛素和多巴胺检测浓度相同时,胰岛素检测信号远强于多巴胺.对胰岛素和多巴胺分别进行特异性实验,发现该传感器对胰岛素和多巴胺有较强的特异性.说明基于荧光共振能量转移的核酸适体传感器不仅可实现多种物质的微量检测,还具有较强的选择性,在生物和医药检测领域应用前景广阔.
关键词荧光共振能量转移    氧化石墨烯    能量受体    荧光适体传感器    微量检测    
中图分类号:TP212      文献标识码:A      文章编号:1004-4213(2017)09-0923003-5
Study of the Fluorescent Aptasensor Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer
JIANG Li-ying, LIU Shuai, REN Lin-jiao, ZHANG Pei, YAN Yan-xia, ZHENG Xiao-wan, CHEN Qing-hua, JIANG Su-xia    
(Department of Electric Information Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No.61002007), Science and Technology Innovation Talents Project of Henan Provence (No.124100510001), Doctoral Foundation of Zhengzhou University of Light Industry (Nos.2014BSJJ041;2015BSJJ023), Graduate Science and Technology Innovation Foundation of Zhengzhou University of Light Industry (No.2016027)
Abstract: One fluorescent aptasensor based on the fluorescence resonance energy transfer was constructed and used to detect insulin and dopamine. Aptamer labeled FAM (aptamer-FAM) was in charge of energy donor, while graphene oxide served as an energy acceptor. The results show that the linear detection range of insulin is from 0.05 μmol/L to 10 μmol/L and dopamine is from 1 μmol/L to 500 μmol/L, meanwhile the signal intensity of insulin is stronger than dopamine at the same concentration. The specificity experiments for insulin and dopamine have indicated that this fluorescent aptasensor have a good specificity. Due to its detection for different targets and high selectivity, this fluorescent aptasensor offers a promising prospect in the detection field of biological and medical.
Key words: Fluorescence resonance energy transfer    Grapheme oxide    Energy acceptor    Fluorescent aptasensor    Trace detection    
OCIS Codes: 230.0040;230.0250;260.2160;260.2510;280.1415;300.6280
0 引言

荧光适体传感器[1-3]是通过换能器将核酸适体[4-6]与靶目标的强亲和力和特异性结合转换为荧光信号的变化,由荧光信号的变化量来对靶目标进行检测分析,具有灵敏度高、检测效率高和操作简单的优点.荧光适体传感器中较常见的是利用荧光基团(供体)和淬灭剂(受体)构建基于荧光共振能量转移体系来测量荧光强度的变化.Wang Bin等[7]以纳米金作为能量受体,与荧光掺氮碳量子点构建荧光淬灭系统,实现了对黄曲霉毒素B1的特异性检测;Hu Kun等[8]利用氧化石墨烯作为淬灭剂和异硫氰酸荧光素作为荧光基团,构建了检测免疫球蛋白E的荧光适体传感器,且具有较好的检测性能.氧化石墨烯[9-11](Graphene Oxide, GO)可以同DNA碱基发生Π-Π堆积相互作用,能吸附单链DNA,并可使其上修饰的荧光基团荧光淬灭,由于它的淬灭效率普遍高于常见的有机淬灭剂,且生产成本低、毒性小,所以是淬灭剂的常用选择.

本研究以FAM荧光基团[12-14]标记的核酸适体作为检测探针,以氧化石墨烯作为淬灭剂,构建了基于荧光共振能量转移的核酸适体传感器,并分别对靶目标胰岛素[15-17](Insulin, INS)和多巴胺[18-20](Dopamine, DA)进行检测,从而验证该传感器的性能.

1 实验 1.1 仪器与试剂

F-7000型荧光光谱仪(日本HITACHI公司);GL-16Ⅱ型离心机(上海安亭科学仪器厂);电子天平和酸度计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);07HWS-2型数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司);DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);牛胰岛素和多巴胺盐酸盐(北京索莱宝科技有限公司);2 mg/mL氧化石墨烯溶液(苏州恒球科技有限公司);标记有FAM荧光基团的核酸适体由上海生工生物科技有限公司(上海)合成,胰岛素适体序列:5′-GGT GGT GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTC-FAM-3′,多巴胺适体序列:5′-FAM-GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3′;50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.4,含30 mmol/L NaCl,50 mmol/L KCl);实验用水为去离子水,实验温度为室温.

1.2 核酸适体的固定

首先将保存于-20℃的装有核酸适体的离心管取出,离心30 s(12 000 rpm)使附在管壁上的适体聚于管底,防止打开时散失,再加入Tris-HCl缓冲液,震荡均匀,将核酸适体激活.将激活后的核酸适体与氧化石墨烯溶液混合,室温下静置一段时间,使核酸适体固定于氧化石墨烯上,并使FAM的荧光淬灭,也即得到不同靶目标的工作溶液,核酸适体与氧化石墨烯的浓度比为100 nmol/L:90 μg/mL.

1.3 靶目标的检测

在胰岛素工作溶液中加入不同浓度胰岛素制得待测液,孵育一段时间后,取3 mL放入荧光光谱仪检测荧光,并以胰岛素工作溶液作为空白对照组,计算不同浓度待测液的荧光强度并绘制标准曲线.同样,测量不同浓度多巴胺待测液的荧光强度并绘制多巴胺标准曲线.

1.4 特异性检测

胰岛素检测的易干扰物质有牛血清蛋白(Bull Serum Albumin, BSA)、生物素(Vitamin H, VH)及链霉亲和素(Streptavidin, SA),分别配置5 μmol/L的待测液,在检测胰岛素相同实验条件下,利用荧光光谱仪检测上述3种待测液的荧光强度,每个样品平行测定3次,将得到的荧光强度与相同浓度的胰岛素的荧光强度作比较,检验该传感器对胰岛素的特异性.

多巴胺检测的易干扰物质有肾上腺素(Epinephrine, E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine, NE)及抗坏血酸(Ascorbic Acid, AA),分别配置200 μmol/L的待测液,将测得的荧光强度与相同浓度多巴胺的荧光强度作比较,检验该传感器对多巴胺的特异性.

2 结果与讨论 2.1 检测原理

以修饰有FAM的核酸适体与氧化石墨烯构建的荧光适体传感器,基于荧光共振能量转移对靶目标检测的原理如图 1所示.未加入靶目标分子时,核酸适体通过Π-Π堆积作用力吸附在GO表面,其上的FAM荧光基团与GO发生能量共振转移,FAM作为供体将能量传递给GO,导致荧光淬灭;加入靶目标分子后,核酸适体与靶分子的特异性结合力强于Π-Π堆积作用力,故核酸适体会脱离氧化石墨烯而与靶分子结合,此时,FAM远离GO表面,能量共振转移作用消失,FAM荧光恢复且荧光强度与加入靶分子的浓度在一定范围内呈正相关的线性关系,检测恢复荧光的强度变化即可实现靶目标的浓度检测.

图 1 检测靶目标的原理 Fig.1 Schematic illustration of the detection of target
2.2 传感器对靶目标的响应特性

为检验该传感器对胰岛素和多巴胺的响应特性,分别检测FAM-核酸适体溶液、工作溶液和加入靶目标分子后的荧光强度,胰岛素的响应特性如图 2所示,多巴胺的响应特性如图 3所示.图中a曲线是FAM-核酸适体溶液的荧光强度,b曲线是加入GO后的工作溶液的荧光强度,c曲线是在工作溶液中加入靶目标后的荧光强度,可以看到,b曲线的荧光强度远低于a曲线,说明GO对FAM具有很好的淬灭效果;c曲线的荧光强度远高于b曲线,说明加入靶分子后,FAM-核酸适体脱离GO,荧光恢复.由此可知该传感器对胰岛素和多巴胺具有较好的响应特性,可以用来检测胰岛素和多巴胺.

图 2 胰岛素响应特性 Fig.2 The response characteristic of insulin
图 3 多巴胺响应特性 Fig.3 The response characteristic of dopamine
2.3 不同浓度靶目标对传感器响应特性的影响

分别对不同浓度胰岛素(0 μmol/L,0.05 μmol/L,1 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L)和多巴胺(0 μmol/L,1μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L,200 μmol/L,500 μmol/L)进行检测,将得到的不同浓度的荧光强度绘制成曲线图,并对靶目标浓度和相应的荧光强度的关系进行分析.图 4为胰岛素的检测范围.图 5为多巴胺的检测范围.

图 4 胰岛素的检测范围 Fig.4 The detection range of insulin
图 5 多巴胺的检测范围 Fig.5 The detection range of dopamine

图 4(a)可知随着胰岛素浓度的不断增大,荧光强度也随之不断地增强,在521 nm波长附近有最大荧光强度,取该处荧光值,做与不同浓度的胰岛素的对应关系图.最终得到胰岛素的线性检测范围如图 4(b)所示,在0.05~10 μmol/L范围内满足线性关系:y=73.14+15.91x, 其中y代表荧光强度,x代表胰岛素浓度,其相关系数R=0.998.

图 5(a)可知随着多巴胺浓度的不断增大,荧光强度也随之不断地增强,在521 nm波长附近有最大荧光强度,取该处荧光值,做与不同浓度的多巴胺的对应关系图.最终得到多巴胺的线性检测范围如图 5(b)所示,在1~500 μmol/L范围内满足线性关系:y=38.66+0.15x, 其中y代表荧光强度,x代表多巴胺浓度,其相关系数R=0.994.

图 4图 5可知,靶目标的浓度越大,传感器的响应特性越强.而且传感器对胰岛素的响应特性要强于多巴胺,低浓度的胰岛素就可产生较大的响应信号,而同样大小的响应信号则需较大浓度的多巴胺.

2.4 传感器的特异性实验

分别对胰岛素和多巴胺两种靶目标进行特异性实验.选择三种各自的易干扰物质,在相同实验条件下,测得靶目标与干扰物在相同浓度时的荧光强度,并作图分析,其中,图 6为胰岛素特异性实验结果,图 7为多巴胺特异性实验结果.

图 6 胰岛素的特异性检测(5 μmol/L) Fig.6 The specific detection of insulin (5 μmol/L)
图 7 多巴胺的特异性检测(200μmol/L) Fig.7 The specific detection of dopamine (200μmol/L)

图 6可知,在胰岛素的线性检测范围内选择一个浓度(5 μmol/L),在相同实验条件下检测,牛血清蛋白、链霉亲和素与生物素等干扰物的荧光强度远远低于胰岛素,并且由(FF0)/(FINSF0)计算相对荧光强度,其中F0F分别表示加入不同选择性物质前后的荧光强度,FINS表示胰岛素的荧光强度,计算其荧光强度比依次为:0.11:0.15:0.12:1.0.因此,该传感器对胰岛素的检测具有较好的特异性.

图 7可知,在多巴胺的线性检测范围内选择一个浓度(200 μmol/L),在相同实验条件下检测,肾上腺素,去肾上腺素与维生素等干扰物的荧光强度远远低于多巴胺,计算的荧光强度比依次为:0.21:0.12:0.18:1.0.因此,该传感器对多巴胺的检测具有较好的特异性.

3 结论

将修饰有FAM的核酸适体与氧化石墨烯构建荧光适体传感器,基于荧光共振能量转移原理对胰岛素和多巴胺不同靶目标进行检测,结果表明该传感器能够实现对胰岛素和多巴胺的特异性检测,同时具备操作简单的优点.使用新型荧光供体材料与受体材料构建荧光适体传感器,并用于生物和医疗方面的小分子检测,具有较大的研究潜力.

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